PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata adalah metode untuk mengukur jumlah total produk setelah setiap siklus reaksi berantai polimerase (PCR) dalam reaksi amplifikasi DNA menggunakan fluorofor.Metode ini digunakan untuk mengukur urutan DNA spesifik dalam sampel yang akan diuji dengan metode referensi internal atau eksternal.Sejak awal, tes PCR kuantitatif fluoresen menjadi semakin populer di kalangan guru laboratorium.
Prinsip PCR Fluoresensi: Fluoresensi PCR, pertama disebut TaqManPCR dan kemudian juga Real-TimePCR, adalah teknik kuantifikasi asam nukleat baru yang dikembangkan oleh PE (PerkinElmer) di AS pada tahun 1995. Teknik ini didasarkan pada penambahan probe berlabel fluoresensi atau yang sesuai pewarna fluoresen ke PCR konvensional untuk mencapai fungsi kuantitatifnya.Prinsipnya: saat reaksi PCR berlangsung, produk reaksi PCR menumpuk dan intensitas sinyal fluoresen meningkat dalam proporsi yang sama.Dengan setiap siklus, sinyal intensitas fluoresensi dikumpulkan sehingga kami dapat memantau perubahan jumlah produk dengan perubahan intensitas fluoresensi dan dengan demikian memperoleh grafik kurva amplifikasi fluoresensi.
Secara umum, kurva amplifikasi fluoresensi dapat dibagi menjadi tiga fase: fase sinyal latar belakang fluoresensi, fase amplifikasi eksponensial sinyal fluoresensi, dan fase dataran tinggi.Selama fase sinyal latar belakang, sinyal fluoresensi yang diperkuat ditutupi oleh sinyal latar belakang fluoresensi dan perubahan jumlah produk tidak dapat ditentukan.Pada fase plateau, produk amplifikasi tidak lagi meningkat secara eksponensial, tidak ada hubungan linier antara jumlah produk akhir dan jumlah template awal, dan jumlah salinan DNA awal tidak dapat dihitung berdasarkan jumlah produk PCR akhir.Hanya dalam fase amplifikasi eksponensial dari sinyal fluoresen terdapat hubungan linier antara logaritma jumlah produk PCR dan jumlah template awal, dan kita dapat memilih untuk mengukurnya pada tahap ini.Untuk kenyamanan kuantifikasi dan perbandingan, dua konsep yang sangat penting telah diperkenalkan ke dalam teknik PCR kuantitatif fluoresen waktu nyata: ambang batas fluoresensi dan nilai CT.
Ambang batas adalah nilai yang ditetapkan secara artifisial pada kurva amplifikasi fluoresensi.fase eksponensial amplifikasi PCR.
Nilai Ct: adalah jumlah siklus yang telah dilalui sinyal fluoresensi di setiap tabung reaksi untuk mencapai nilai domain yang ditetapkan.
Hubungan antara nilai Ct dan template awal: penelitian telah menunjukkan bahwa nilai Ct setiap template memiliki hubungan linier dengan logaritma dari jumlah salinan awal dari template tersebut, semakin banyak salinan nomor salinan awal, semakin kecil Ct nilai.Nilai Ct relatif stabil.Kurva standar dapat dibuat dengan menggunakan standar dengan nomor salinan awal yang diketahui, di mana koordinat horizontal mewakili logaritma dari nomor salinan awal dan koordinat vertikal mewakili nilai Ct seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah.
Oleh karena itu, dengan memperoleh nilai Ct dari sampel yang tidak diketahui, jumlah salinan awal sampel tersebut dapat dihitung dari kurva standar.
Nilai Ct tidak konstan dan dapat dipengaruhi oleh sampel yang berbeda dan instrumen yang berbeda, bahkan jika sampel yang sama diulang 2 kali pada instrumen yang sama, nilai Ct dapat bervariasi.
Uji fluoresensi kuantitatif: Uji fluoresensi kuantitatif dapat dibagi menjadi probe fluoresen dan pewarna fluoresen tergantung pada penanda yang digunakan.Probe fluorescent termasuk teknologi Beacon (teknologi beacon molekul, diwakili oleh American Tagyi), probe TaqMan (diwakili oleh ABI) dan teknologi FRET (diwakili oleh Roche);pewarna fluoresen termasuk pewarna fluoresen jenuh dan pewarna fluoresen tidak jenuh, perwakilan khas dari pewarna fluoresen tak jenuh adalah SYBRGreen I, yang umum digunakan sekarang;jenuh Perwakilan khas dari pewarna fluoresen tak jenuh adalah SYBRGreenⅠ;pewarna fluoresen jenuh adalah EvaGreen, LCGreen, dll.
SYBRGreenI adalah pewarna pengikat DNA yang umum digunakan untuk PCR fluoresen, yang mengikat non-spesifik ke DNA untai ganda.Dalam keadaan bebasnya, SYBRGreenI memancarkan fluoresensi yang lemah, tetapi begitu terikat pada DNA untai ganda, fluoresensinya meningkat 1000 kali lipat.Oleh karena itu, sinyal fluoresensi total yang dipancarkan oleh suatu reaksi sebanding dengan jumlah DNA untai ganda yang ada dan meningkat seiring dengan meningkatnya produk amplifikasi.
Keuntungan dari pewarna pengikat DNA untai ganda: desain eksperimental sederhana, hanya diperlukan 2 primer, tidak perlu merancang probe, tidak perlu merancang banyak probe untuk pengujian cepat beberapa gen, kemampuan untuk melakukan analisis kurva titik leleh, menguji spesifisitas reaksi amplifikasi, biaya awal yang rendah, generalisasi yang baik dan oleh karena itu lebih umum digunakan dalam penelitian di dalam dan luar negeri.
Metode probe fluoresen (teknik Taqman): Ketika amplifikasi PCR dilakukan, sepasang primer ditambahkan bersama dengan probe fluoresen tertentu.Ketika probe utuh, sinyal fluoresensi yang dipancarkan oleh kelompok reporter diserap oleh kelompok yang dipadamkan dan tidak terdeteksi oleh instrumen PCR;selama amplifikasi PCR (dalam fase ekstensi), aktivitas pembelahan 5'-3' dari enzim Taq menurunkan probe secara enzimatik, membuat kelompok fluoresensi reporter dan kelompok fluoresensi yang dipadamkan
Aplikasi PCR kuantitatif fluoresen.
Penelitian biologi molekuler:
1. Analisis asam nukleat kuantitatif.Analisis kuantitatif dan kualitatif penyakit menular, deteksi mikroorganisme atau virus patogen, seperti epidemi influenza A (H1N1) baru-baru ini, deteksi jumlah salinan gen tanaman dan hewan transgenik, deteksi tingkat inaktivasi gen RNAi, dll.
2. Analisis ekspresi gen diferensial.Perbandingan perbedaan ekspresi gen antara sampel yang diberi perlakuan (misalnya perlakuan obat, perlakuan fisik, perlakuan kimia, dll.), perbedaan ekspresi gen spesifik dalam fase yang berbeda dan konfirmasi microarray cDNA atau hasil ekspresi diferensial
3. Deteksi SNP.Deteksi polimorfisme nukleotida tunggal penting untuk mempelajari kerentanan individu terhadap penyakit yang berbeda atau respons individu terhadap obat tertentu, dan karena struktur suar molekul yang cerdik, setelah informasi urutan SNP diketahui, mudah dan akurat untuk gunakan teknik ini untuk deteksi SNP throughput tinggi.
4. Deteksi metilasi.Metilasi dikaitkan dengan banyak penyakit manusia, terutama kanker, dan Laird melaporkan teknik yang disebut Methylight, yang memperlakukan DNA sebelum amplifikasi sehingga sitosin yang tidak termetilasi menjadi urasil dan sitosin yang termetilasi tidak terpengaruh, menggunakan primer spesifik dan probe Taqman untuk membedakan antara DNA termetilasi dan tidak termetilasi. .lebih sensitif.
Penelitian medis:
1. Diagnosis prenatal: orang tidak dapat mengobati penyakit keturunan yang disebabkan oleh perubahan materi genetik, dan sejauh ini, mereka hanya dapat mengurangi jumlah bayi sakit yang lahir melalui pemantauan prenatal untuk mencegah terjadinya berbagai penyakit keturunan.Ini adalah metode non-invasif yang mudah diterima oleh ibu hamil.
2. Deteksi patogen: Uji PCR kuantitatif fluoresen memungkinkan penentuan kuantitatif patogen seperti gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, virus papiloma manusia, virus herpes simpleks, virus imunodefisiensi manusia, virus hepatitis, virus influenza, Mycobacterium tuberculosis, EBV dan cytomegalovirus.Ini memiliki keunggulan sensitivitas tinggi, ukuran sampel rendah, kecepatan dan kesederhanaan dibandingkan dengan metode pengujian tradisional.
3. Penilaian kemanjuran obat: analisis kuantitatif virus hepatitis B (HBV) dan virus hepatitis C (HCV) menunjukkan bahwa ada hubungan antara viral load dan kemanjuran obat tertentu.Jika tingkat serum HBV-DNA menurun selama pengobatan lamivudine dan kemudian meningkat lagi atau melebihi tingkat sebelumnya, ini merupakan indikasi mutasi virus.
4. Pengujian onkogenetik: Meskipun mekanisme perkembangan tumor belum jelas, telah diterima secara luas bahwa mutasi pada gen yang relevan adalah penyebab yang mendasari transformasi onkogenik.Peningkatan ekspresi dan mutasi onkogen dapat dilihat pada tahap awal banyak tumor.PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata tidak hanya efektif dalam mendeteksi mutasi pada gen, tetapi juga dapat secara akurat mendeteksi ekspresi onkogen.Metode ini telah digunakan untuk mendeteksi ekspresi berbagai gen termasuk gen telomerase hTERT, gen WT1 leukemia granulositik kronis, gen ER onkogenik, gen PSM kanker prostat, dan gen virus terkait tumor.
Diterjemahkan dengan www.DeepL.com/Translator (versi gratis)
Waktu posting: 21 Juni-2022